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采用實(shí)時熒光PCR技術(shù)，針對單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針。PCR擴(kuò)增過程中，與模板結(jié)合的探針被Taq酶分解產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號繪制出實(shí)時擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞增生李斯特菌在核酸水平上的定性檢測。

1、核酸提取????????

1）取40μL增菌液于裂解液管中，98℃或沸水浴10min。

2）冷卻至室溫，吸取上清備用或者置于-20℃保存。

2、反應(yīng)體系配置

從試劑盒中取出LM預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，然后將陰性對照、樣品的DNA提取液、陽性對照各取5μL分別加入PCR管或PCR板中，蓋好管蓋或板膜，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

3、PCR擴(kuò)增???????

PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個循環(huán)60℃時檢測熒光信號，檢測通道選擇CY5。

注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均選擇“none”。