采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對梭菌特異性基因設(shè)計(jì)引物和探針。PCR擴(kuò)增過程中，與模板結(jié)合的探針被Taq酶分解產(chǎn)生熒光信號，熒光定量PCR儀根據(jù)檢測到的熒光信號繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，從而實(shí)現(xiàn)梭菌在核酸水平上的菌種鑒定。本產(chǎn)品可以鑒定丁酸梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、新生兒梭菌、艱難梭菌、生孢梭菌、肉毒梭菌、巴氏梭菌等菌株，同時(shí)可以鑒定肉毒梭菌的產(chǎn)毒基因，即bont/A、bont/B、bont/E和bont/F的基因。
1、核酸提取????????
加熱法：刮取至少10個(gè)菌落，懸浮于100μL的無菌水中，漩渦震蕩10s（如果菌落未能均勻分散，可適當(dāng)延長震蕩時(shí)間），95℃或沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，吸取上清。
試劑盒法：可使用商品化的試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA。
2、反應(yīng)體系配置
從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后將模板各取5μL分別加入PCR管或PCR板中（每種模板要使用四種預(yù)混液），蓋好管蓋或板膜，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
3、PCR擴(kuò)增???????
PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應(yīng)程序設(shè)定如下：反應(yīng)體系為25μL，在第二步每個(gè)循環(huán)60℃時(shí)檢測熒光信號，檢測通道選擇FAM、HEX（VIC）、CY5。
第一步 | 第二步 | ||
1個(gè)循環(huán) | 40個(gè)循環(huán) | ||
95℃ | 95℃ | 60℃√ | 72℃ |
10min | 20s | 60s√ | 30s |
注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均選擇“none”。
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