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采用實時熒光PCR技術，針對致瀉大腸埃希氏菌（DEC）特異性基因設計引物和探針。PCR擴增過程中，與模板結合的探針被Taq酶分解產生熒光信號，熒光定量PCR儀根據檢測到的熒光信號繪制出實時擴增曲線，從而實現致瀉大腸埃希氏菌（DEC）在核酸水平上的菌株鑒定。

1、核酸提取????????

加熱法：刮取一環(huán)菌落，懸浮于100μL的無菌水中，漩渦震蕩10s（如果菌落未能均勻分散，可適當延長震蕩時間），95℃或沸水浴5min，冷卻至室溫，12000rpm離心5min，吸取上清。

試劑盒法：可使用商品化的試劑盒提取細菌的基因組DNA。

2、反應體系配置

從試劑盒中取出預混液，充分融化，渦旋后短暫離心，取20μL置于PCR管或PCR板中，然后各取模板5μL分別加入PCR管或PCR板中（每種模板要使用五種預混液），蓋好管蓋或板膜，短暫離心，立即進行PCR擴增反應。

3、PCR擴增???????

PCR管或PCR板置于PCR儀上，推薦反應程序設定如下：反應體系為25μL，在第二步每個循環(huán)60℃時檢測熒光信號，檢測通道選擇FAM、HEX（VIC）、CY5。

注：使用ABI系列PCR儀器，如果不添加ROX，“passive reference”和 “quencher”均選擇“none”。